≪免疫毒性試験プロトコール　6≫

ラットにおけるインビボ抗SRBC抗体産生 (スライドグラスを用いるPFCアッセイ)


1999; 4(2), 7-10

手島　玲子，澤田　純一
国立医薬品食品衛生研究所　機能生化学部

A. 解説

　Jerneらによるplaque forming cell assay (PFCアッセイ) は，抗体を産生している細胞の数を溶血斑として計数する方法として，免疫学において広く用いられている1,2)。この方法には多くの変法が報告されており3-12)，マウスを用いるPFCアッセイに関しては，非常に多数の報告がなされている。ここでは，比較的報告例が少ない，ラットを用いてインビボ抗体 (IgMクラス) 産生能を試験する場合の例を紹介したい。なお，本法では，多数の被験細胞のPFCアッセイが，比較的容易であるスライド法5,9,10,11)を用いているが，通常のディッシュを用いる方法2,9,10,12)によっても良い。

B. 実験材料等

1. ヒツジ赤血球 (SRBC)

SRBCのロットによりPFC数が異なる場合があるので，C.方法に従って，1ロット当たり3匹程度の正常動物を用いて免疫してPFCアッセイを行い，SRBCのロット検定を行っておくことが望ましい。免疫とPFCアッセイには同じロットの血球を用いる。SRBCとしては，採血時にAlsever氏液を添加した保存ヒツジ赤血球が市販されている。採血及び保存状態にもよるが，通常，採血後1ヶ月は使用可能である場合が多い。購入後，遠心管に無菌的に分注しておく。採血直後のものよりも，1週間以上後の方がPFCアッセイにはよいとされているが，古すぎるものは溶血しやすい10)。使用日に，Eagle's MEM (MEM) 培地にて，4回の遠心 (3000rpm，5～10min，4℃) により洗浄を行い (ポリスチレン製の遠心管は，小さな傷があると遠心により割れ易いので，注意を要する)，溶血が著しくないことを確認して用いる。免疫の際には，滅菌された培養液 (下記) を洗いに用いる。PFCアッセイの前には，packed cells (100%) の状態として氷上に置いておき，直前に室温に戻すとよい。

2. 培養液

　筆者らは，炭酸ガスを使用しない通常のふらん器を使用しているため，1M NaOHを用いてpHを7.2に調整したEagle's MEM (2mM L-glutamine及びカナマイシン含有) (以下MEMと省略) を使用している。用いる培養液としては，通常免疫学で繁用される，RPMI-1640，Dulbecco's modified MEM等を用いてもよいが，より廉価であるMEMを用いて問題無い。炭酸ガス培養器を用いる場合には，培養液のbuffer系として必要な，重炭酸ナトリウム (さらに，10mＭ程度のHEPESバッファーを添加した方がよい) を代わりに添加する必要がある。PFCアッセイに用いる培養液は，必ずしも無菌的である必要はないが，用時調製するか，凍結保存5X濃縮液を使用時に希釈して用いることが望まれる。

3. 1% agarose (SeaPlaque)

　用いるagarまたはagaroseに関しては，種々の処方9,10,12)が知られているが，筆者らは，抗補体作用がなく，低融点であるため取扱いが便利なSeaPlaque agarose (FMC Co.) を単独で用いている。PFCアッセイの直前に上記MEMに加え，煮沸により (または電子レンジで) 溶かし，45℃の水浴上に，ガラス試験管 (16×125mm) に5mlずつ分注して置いておく。

4. モルモット補体

　正常モルモット新鮮血より得られた血清を，ヒツジ赤血球で吸収したもの。市販の乾燥補体 (デンカ生研社等の製品) を用いればよい。30-40倍希釈 (希釈度は予め確認しておく) のMEM溶液を使用直前に作製。

5. 2% FCS-MEM

　2% (v/v) となるように，非働化したfetal calf serum (FCS) をMEMに加えたもの。脾臓細胞の調製に用いる。この濃度のFCSを用いる限り，脾臓細胞調製液から持ち込まれるFCSは，PFCアッセイの際に用いられる補体の活性を阻害しない。

6. 脾臓細胞調製用ディッシュ

　ガラス (シリコン処理したものが望ましい) またはプラスチック (培養用の親水処理がされていないもの) のディッシュ (直径約6cm) を脾臓の数だけ用意し，各ディッシュに2% FCS-MEMを10mlずつ分注し氷冷しておく。

7. PFCアッセイ用スライドグラスのprecoating

　スライドグラスには通常のフロスト付きで洗浄済みのもの (26×76mm；15mm-フロスト) を用いる。煮沸により溶解した0.2% agarose (通常の電気泳動用グレードのagaroseでもよい) 水溶液にスライドグラス透明部分を浸し，よくagarose液を切った後，風乾して，保存する (よく乾燥してあれば，少なくとも，室温で2-3ヶ月は保存できる)。この操作は，スライドグラス表面にagaroseの薄膜を被覆しておき，PFCアッセイの際に載せたagaroseが固化した後，離れないようにするために行う。アッセイの前に，下記のトレイに必要数のスライドグラスを予め並べ，フロスト部分に番号を記しておく。

8. スライドグラス用のトレイ

　文献5，9，10，11に従って，専用のプラスチック製のトレイを，必要数，用意する。業者に注文してもよいが，アクリル板を有機溶剤で貼り合わせて，自作することも簡単にできる。文献5，9，10のトレイは1連のものであるが，文献11の2連のものが使いやすい。

9. その他

　免疫に用いるディスポーザブル注射筒及び注射針，解剖用具，水浴 (45℃)，ふらん器 (または，炭酸ガス培養器) (37℃)，agarose溶解のための電子レンジまたは煮沸用器具 (ガラス三角フラスコ，ガスバーナー，セラミック付き金網，ビーカー)，ガラスまたはプラスチック試験管 (有核細胞数計数，agarose/脾臓細胞の混和等に用いる)，試験管用ラック，メランジュール (白)，血球計算板，colony counter (最も簡便なものとしては，セキスイ製のペン型プラークカウンターがある)，メスピペット，駒込ピペット，マイクロピペット及びチップ等が必要とされる。

C. 実験操作手順

1. 免疫

　PFCアッセイを行う4日前に，無菌的に調製した1% SRBC 1ml (約2×108) をラット尾静脈より，投与する。28日間反復経口投与の場合には，25日目に免疫し，29日目にPFCアッセイという日程となる。各群8匹以上使用することが望ましい。

2. 脾臓細胞調製

1)　免疫後，4日目に，必要な測定 (体重等) を行った後，エーテル麻酔下，脱頚，開腹後，脾臓を摘出する。付着している脂肪組織があれば取り除き，必要に応じて，脾臓重量を測定する。

2) 摘出した脾臓を氷冷した2% FCS-MEM (10ml) をいれたディッシュに (脾臓毎に別のディッシュに) 移す。

3) 脾臓をピンセット (眼科用の先曲がりのものが使いやすい) 2本で，大きな塊が無くなるまでほぐす。別法としては，ステンレスメッシュを通す方法や，フロスト付きスライドグラスを2枚用いて，フロスト部分で脾臓を挟んでつぶつ様にしてほぐす方法もある。

4) 脾臓細胞を15mlプラスチック遠沈管に移す。1分放置後，cell debrisを吸い上げないように注意して細胞液だけを吸い上げ，別の遠沈管に移す。cell debrisに約5mlの2% FCS-MEMを加え混ぜた後，同じ操作を行い上清をまとめる。別法としては，ナイロンメッシュを通して，cell debrisを除いてもよい。この脾臓細胞液を遠心 (4℃，1500rpm，5min) する。

5) cell pellet を，遠心により洗った後，10mlの2% FCS-MEMに懸濁する (大体3×107/ml程度の有核細胞密度となる)。10倍希釈の細胞液を作製する。必要に応じて (ロット検定の結果に応じて)，その20倍または40倍希釈の細胞液を作製する場合もある。有核細胞の計数には，9倍量のTurk液 (0.01% gentiana violet-3% acetic acid) を加えて (メランジュールを用いてもよい)，血球計算板を用いて行う。この計数は，下記の3.3) 及び4) 行程の間に行うことができる。

3. PFCアッセイ

1)　1% agarose 5mlに対し，ヒツジ赤血球0.2ml (packed cells) を加え，4% SRBC-agarose液とし，45℃の水浴にもどす。このSRBC-agarose液は，必要量を一度に作らず，時間をずらして作製する方がよい。

2)　脾臓細胞液0.1mlを試験管 (Falcon #2008または10×75mmディスポーザブルガラスチューブが使い易い) にとり，上記SRBC-agarose液0.5mlを加え，vortex mixierを用いてよく混ぜて，スライドグラスの透明部の上に，試験管を逆さまにしたまま動かして，均一の厚さになるようにまく。気泡がある場合には，注射針，パスツールピペット等で，はじかせる。脾臓細胞液 (0.1ml) を試験管に移す際には，一度に数検体にとどめ，多数の検体を同時に移さない方がよい (抗体産生細胞はガラス壁等に付着しやすい傾向があるため)。agaroseが固化したら直ちに，スライドグラスを，裏向けて，agarose部分が下になるようにする。1検体当たり，スライドグラス2枚以上を使用する。予備のトレイを覆いの代わりに用いるとよい。

3)　37℃で，90分のincubationを行う。

4)　希釈した補体を，トレイとスライドグラスの隙間に加え，気泡を除いた後，37℃で，再び90分，incubationを行う。

5)　PFCの計数を行う。colony counter等を利用して，plaque数を，2時間以内に計数する。スライドグラス当たりのPFC数及び有核細胞数より，計算により，106脾臓細胞当たりのPFC数並びに脾臓当たりのPFC数を求める。colony counterが無い場合には，light boxの上で，先の細いマジックペン (水性) を用いて，スライドグラスのagaroseのない面から，溶血斑に点を打ちながら計数してゆく。通常，スライドグラス当たりのPFC数が200を超さないよう，脾臓細胞を希釈することが望ましい。スライドグラス当たりのPFC数が300を超す場合には，計数が不正確となるので，脾臓細胞の希釈を高める必要がある。

D.　判定及び参考値

1.　F344ラット (日本チャールスリバー) の場合，106脾臓細胞当たり1000PFCs前後の値が得られる。

2.　写真撮影用のlight boxや，X線フィルム観察用のシャーカッセン等を用いてスライドグラスをみると，通常の溶血斑 (plaque) は，肉眼できれいに識別できる。対照群の検体でplaqueの径が非常に小さい場合には，方法上の問題があると考えた方が良い。

E. 留意事項

1.　免疫法としては，腹腔内投与の方が初心者には容易であるが，より高いPFC数を一定して得 るためには，習熟者による静脈内投与が望ましい。

2.　購入したSRBCが，溶血しやすい場合には，MEMよりもRPMI-1640を用いた方が良い場合を経験している。
3.　スライドグラスを用いる方法の原理は，原報のものと全く同じであり，ディッシュの代わりにスライドグラスを使っている。ふらん器を用いる場合には，ふらん器内の空気が対流するタイプが望ましい。また，agaroseのゲルが乾燥しないように，ふらん器内の湿度をほぼ100%に保つ必要がある (水を張ったバットをふらん器の底に置いておけば問題はない)。炭酸ガス培養器で，CO2を用いないことも可能である。炭酸ガス培養器を用いる場合には，通常湿度が100%であるので，湿度は問題とならないが，重炭酸ナトリウムのbuffer系を用いるため，agarose液のpH管理が難しいのが欠点となる。煮沸後のagaroseをアルカリでpHを調整したり，pH上昇を防ぐために，煮沸後のagarose水溶液に2倍濃度の加温培養液を加えることが行われている10,11)。　　

4.　SeaPlaque agaroseの代わりとしては，通常，Bacto agar (Difco) にDEAE-dextranを添加して用いる10)。SeaPlaque agaroseの場合には，42℃でもゲル化は起きないので，42℃の水浴を用いてもよい。

5.　SRBCの洗いが不十分な時などには，非常に小さい偽のplaqueがでることがあるので，常に脾臓細胞無しの対照のスライドグラスを，トレイ当たり1枚用意しておくとよい。

6.　脾臓細胞の調製の際の脾臓のほぐし方が，脾臓毎に一定になるように習熟し，また，大きな細胞塊を持ち込まないことが重要である。C. 2. 3) 項で，脾臓をほぐす際に，ステンレスメッシュを用いる方法11)もあるが，脾臓の数だけ，メッシュを用意し，洗浄の後，サビがでないよう管理する必要がある。

7.　何らかの理由により，スライドグラスの保存を行いたい場合には，固定用の溶液により処理した後，保存することも可能である10-12)。

8.　長期の反復投与の後にPFCアッセイを行う場合には，失敗を避けるため，充分に事前の練習及び準備を行う必要がある。


F. 参考文献

1. Jerne, N.K. and Nordin, A.A. (1963) Plaque formation in agar by single antibody producing cells. Science, 140: 405.
2. Jerne, N.K., et al. (1963) The agar plaque technique for recognizing antibody-producing cells. In "Cell Bound Antibodies" (ed. by Amos, B. and Koprowski, H.), Wistar Institute Press, Philadelphia, pp.109-125.
3. Sterzl, J. and Riha, I. (1965) A localized haemolysis in gel method for the detection of cells producing 7S antibody. Nature, 208: 858-859.
4. Dresser, D.W. and Wortis, H.H. (1965) Use of an antiglobulin serum to detect cells producing antibody with low haemolytic efficiency. Nature, 208: 859-861.
5. Mishell, R.I. and Dutton, R.W. (1967) Immunization of dissociated spleen cell cultures from normal mice. J. Exp. Med., 126: 423-442.
6. Cunningham, A.J. and Szenberg, A. (1968) Further improvements in plaque technique for detecting single antibody-forming cells. Immunology, 14: 599-601.
7. Nossal, G.J.V. et al. (1970) In vitro technique of high sensitivity enabling access to the cells. J. Exp. Med., 131: 894-916.
8. Kennedy, J.C. and Axelrad, M.A. (1971) An improved assay for haemolytic plaque-forming cells. Immunology, 20: 253-257.
9. Dresser, D.W. and Greaves, M.F. (1973) Assays for antibody-producing cells. In "Handbook of Experimental Immunology (2nd ed.)", ed. by Weir, D.M., Blackwell Scientific Publ., Oxford, pp.27.1-27.29
10. Jerne, N.K., et al. (1976) Section 26.D. Plaque techniques for recognizing individual antibody-forming cells. In "Methods in Immunology and Immunochemistry. Vol.5 Antigen-Antibody Reactions in Vivo", ed. by Williams, C.A. and Chase, M.W., Academic Press, New York, pp.335-370.
11. Garvey, J.S., Cremer, N.E. and Sussdorf, D.H. (1977) Methods in Immunology (3rd ed.), W.A. Benjamin, Inc, pp.411-442.
12. 岸本進 (1971) JerneのAntibody Plaque法およびCunninghamの方法. 免疫実験操作法Ⅰ，日本免疫学会編，pp.123-127 (免疫実験操作法A，p.479-483に相当).